pcr擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接法克隆實(shí)驗(yàn)原理：
平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的pcr產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用ecor v或sma i切成平頭；pcr產(chǎn)物純化后，可以在22℃用dna聚合酶i作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，pcr產(chǎn)物也可不加處理。如果使用stratagene公司的pfu dna聚合酶或new england biolabs公司的vent dna聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴(kuò)增出來的pcr產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入peg 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情況下，pcr產(chǎn)物可直接與平端載體dna進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)閠aq dna聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條 dna鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的pcr產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的dna分子。
這種dna分子的連接效率很低。由于pcr產(chǎn)物的效率通過較高，在采用大量t4 dna連接酶并配以5-10u t4 rna連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。
對于較短pcr產(chǎn)物，用pus19的hincⅱ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以x-gal和iptg篩選，?？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用klenow大片段或t4dna聚合酶消去3'末端突出堿基將pcr產(chǎn)物變成平端dna，然后再用平端連接法克隆pcr產(chǎn)物。