用于高通量篩選的斑馬魚的新型成像和分析
by jayne hesley, evan cromwell, paula rickert gedraitis, grischa chandy, michael sjaastad, and timothy baranowski1mds analytical technologies (us) inc., sunnyvale, california zygogen llc, atlanta, georgia1
摘要
大型生物體，如斑馬魚胚胎，已成為開發(fā)用于藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學研究的疾病相關(guān)檢測的有吸引力的模型系統(tǒng)。執(zhí)行這些檢驗的一個限制是要有快速圖像采集系統(tǒng)，該系統(tǒng)要具有足夠的分辨率和景深來準確表征此類生物體。第二個限制是對復雜圖像的分析，以提供對測定中感興趣的生物學特征的快速和準確的量化。此處，我們報告了isocyte® 激光掃描成像儀用于三維目標的高通量圖像采集，同時結(jié)合metaxpress®和acuityxpress®軟件應用程序，用于可視化和數(shù)據(jù)分析。專有的光學系統(tǒng)具有大景深（400 μm），可以在不到5分鐘的時間內(nèi)為每個微孔板采集全孔圖像。圖像是在兩個激光散射中同時獲得的，它提供了物體的無標記圖像，以及最多三個其他熒光通道（例如，綠色熒光蛋白標記的血管）。此處將介紹384 孔板格式的兩個應用程序。在一個例子中，分析了用于鑒定影響血管生成血管的治療劑的活z-tag斑馬魚胚胎(zygogen)。在另一個例子中，測試了一組物質(zhì)不同劑量對發(fā)育中的斑馬魚胚胎的急性毒性作用。結(jié)果表明，使用組合的數(shù)據(jù)采集和分析軟件可以快速準確地對血管進行計數(shù)，并且可以快速測量對形態(tài)學的毒性影響。
簡介
斑馬魚為測試化合物的效果提供了一個有吸引力的模型，因為它們結(jié)合了基于細胞的檢測的通量和動物模型的生物學相關(guān)性。由于斑馬魚胚胎在頭5 天內(nèi)發(fā)育出大部分主要器官系統(tǒng)，并且具有可滲透的、透明的皮膚很容易使感興趣的特定組織可視化，尤其是在熒光報告蛋白的幫助下。本研究調(diào)查了1）血管生成抑制化合物（vatalanib/ptk787）對在其脈管系統(tǒng)中表達綠礁珊瑚熒光蛋白的發(fā)育中的胚胎尾部血管形成的劑量依賴性影響；2）不同劑量已知毒性化合物處理24小時對斑馬魚胚胎的長度和形態(tài)的影響。為了在篩選場景中有效利用胚胎，將它們活著分配到384孔微孔板的孔中，加入藥物，并在isocyte®dl激光掃描成像儀上進行掃描。同步獲取的圖像能顯示熒光信號和激光散射（類似于明場）信號。生成的圖像在采集過程中“即時”分析，或?qū)雖etaxpress®軟件進行分析。
材料和方法
z-tagsm血管生成試驗入門試劑盒（zygogen）
z-tag熒光血管胚胎（zygogen）
二甲基亞（sigma, pn 276855）
乙醇（sigma, pn 459836）
馬拉息昂（spectracide 50%）
六氯酚（sigma pn 4-0323）
三聚氰胺（beacon analytical, pn 20-0158）
384孔玻璃底微孔板（matrical, mgb1011-hg）
血管生成分析程序
在進行運輸前，受精1天后的胚胎用zygogen進行酶解脫氯，用不同劑量的vatalanib/ptk787或1%二甲基亞砜進行處理。收到后，384孔透明底板每孔加入60ul溶液并置入一個胚胎。胚胎按照每個劑量5-8復孔按列排列。在孔板內(nèi)平衡2小時后，胚胎用2.5ul0.4%的三卡因麻醉。30分鐘后，斑馬魚32g離心1分鐘，使其平鋪在孔板底部。受精2天后的魚用isocyte成像儀進行掃描，設置如表1。
表1. 用于斑馬魚掃描的isocytetm儀器設置
isocyte設置
血管生成分析
急性毒性分析
激發(fā)光源
488納米激光
488納米激光
gfp發(fā)射
510-540納米
510-540納米
激光掃描發(fā)射
475-485納米
475-485納米
掃描面積
3200×3200微米（比整孔大10%）
3200×3200微米（比整孔大10%）
分辨率
5×5微米
5×5微米
數(shù)據(jù)平均
2均值/像素
1均值/像素
isocyte數(shù)據(jù)除了保存為mdcstoretm（數(shù)據(jù)庫）兼容的單個tif文件外，還自動保存為一平板原始圖像。將tif圖像從數(shù)據(jù)庫導入到metamorph®或metaxpress®軟件中，使用包含神經(jīng)突生長模塊的簡單期刊進行分析，該模塊適用于計數(shù)從尾巴主血管發(fā)芽的熒光血管。
圖1. metaxpress®軟件中的神經(jīng)突生長模塊
急性毒性分析程序
胚胎在受精1天后由zygogen去氯離子。在受精2天后收到，按384孔板每孔1個胚胎轉(zhuǎn)移到40 ul的溶液中。胚胎按照每個劑量7復孔按列排列。將40ul 2倍濃度的6種化合物加入適當?shù)奶幚砜字?，并將胚胎?8℃下孵育24小時。掃描前30分鐘，通過加入5ul的0.4%三卡因麻醉胚胎。將魚在32g下離心1分鐘以使其平鋪在孔底，受精3天后的魚用isocyte成像儀進行掃描，儀器設置如表1。
isocyte®數(shù)據(jù)除了保存為mdcstoretm（數(shù)據(jù)庫）兼容的單個tif文件外，還自動保存為一平板原始圖像。將tif圖像從數(shù)據(jù)庫導入metaxpress®軟件進行分析，使用journal進行分析，該journal使用組合的熒光和散射圖像創(chuàng)建掩模（mask），然后報告形態(tài)測量參數(shù)（例如長度）以及強度測量。
結(jié)果
血管生成分析
整個384孔板在isocyte®成像儀上掃描并保存在8分鐘內(nèi)完成。熒光和散射圖像可以在采集時查看。參見圖2，查看具有vatalanib劑量反應的斑馬魚gfp圖像的示例。
圖2.在增加vatalanib劑量的熒光圖像中尾血管分支發(fā)育的抑制很明顯。
用戶可以選擇在isocyte成像儀上掃描后要自動保存的6種不同文件類型中的哪一種。該掃描被保存為單個680 mb原始數(shù)據(jù)文件（384孔中的2個波長）和tif圖像文件夾，以便于導入metamorph®軟件。創(chuàng)建了一個metamorph®分析journal，該journal裁剪了圖像并利用neurite outgrowth應用模塊來識別和定量尾部的熒光血管。圖3顯示了分析的步驟。用journal自動分析整個孔板的圖像，并將數(shù)據(jù)輸出記錄到數(shù)據(jù)庫文件或excel電子表格中。
圖3.metamorph®血管生成圖像分析示意圖。
繪制了計數(shù)血管的數(shù)量。圖4顯示了根據(jù)dmso對照校正的平均結(jié)果。誤差線表示重復的標準誤差。對血管形成的抑制與在zygogen觀察到的結(jié)果一致。
圖4. 隨著藥物劑量的增加，尾血管形成減少。
急性毒性分析
由于急性毒性測定依賴于胚胎體內(nèi)的顯而易見的形態(tài)變化，因此在掃描過程中沒有進行像素平均，并且在4分鐘內(nèi)對整個384孔板進行了成像和保存。圖5是在isocyte成像儀上采集的gfp和散射圖像的疊加圖。
圖5. 隨著劑量的增加，毒性作用是可見的。激光散射信號增加而gfp強度降低。
通常，急性毒性作用被測量為由于生病胚胎發(fā)育遲緩或卷曲而導致的總胚胎長度差異。這種分析可以通過將isocyte圖像導入metaxpress®軟件并使用集成形態(tài)測量分析來測量長度來完成。將長度平均值與采集過程中分析的圖像的散射強度進行比較。圖6表明，在這種情況下，散射強度是急性毒性的最佳指標。圖7顯示了使用isocyte軟件測定的總激光散射信號對6種化合物的毒性影響。
圖6. 隨著劑量的增加，毒性作用是可見的。激光散射信號增加比魚長減少更明顯。
圖7. 激光散射信號顯示了6種不同化合物的毒性作用的比較。
總結(jié)
isocyte®激光掃描成像儀非常適合在激光散射和熒光中同時快速采集斑馬魚圖像，而無需耗時的聚焦步驟。使用isocyte軟件的即時分析實現(xiàn)了自動斑馬魚毒性篩查。使用metaxpress®軟件和現(xiàn)有應用模塊以半自動方式完成血管生成的復雜圖像處理。